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            BLT小課堂 | 螢火蟲螢光素酶在ATP檢測中的應用

            2020/4/18


            螢火蟲螢光素酶在ATP檢測中的應用

            前言:

                  生物發光是一種在生物體內由酶將化學能轉化為光能的現象,在自然界中有超過30種生物發光體系,而我們所熟知的螢火蟲的發光體系就是其中研究最早,應用也最廣泛的一種。螢火蟲的發光現象是由其體內的螢光素酶(luciferase)的催化下三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)與發光底物螢光素(lucierin)發生反應產生光。

                  ATP被認為是一種在所有生物體生存和繁殖的細胞合成中必不可少的普遍能量來源,形象的說,它是一種通用的能量“貨幣”。ATP可以通過水解產生AMP和一個磷酸基團,同時釋放出能量,供給細胞活動。



            ATP結構圖

            發光反應的方程式:


            研究歷史:
                  1885年螢光素及螢光素酶第一次被Dubois提取出來;1952年Strehler和Totter首次使用螢光素酶粗制品測定ATP;1961年White等人工合成了螢光素;1985年Dewet, JR等首次克隆了P. Pyralis螢光素酶基因并在大腸桿菌中表達,從中得到具有活性的螢光素酶,從而開啟了螢光素酶作為報告基因的歷程。
                  ATP的含量直接反應了細胞或微生物的含量,通過監測ATP含量的改變,可以評價多種藥物、生物制劑或生物活性物質引起的細胞殺傷、細胞抑制和細胞增殖作用;另外ATP也常作為微生物污染的一個指標,檢測ATP含量能直接反映出其受污染程度。測定生物體中ATP的水平及其動態變化便成為監測生物體必不可少的手段。接下來,小編將向大家具體介紹一下他在近年來的應用領域。

            <應用領域>


            01
            食品安全


                  人類的身體健康、生命安全長期受到微生物污染的威脅,營養瓊脂平板計數法是國際上針對微生物檢測的現有標準方法,然而該方法要求在 37 ℃下持續培養 48 h,過于繁瑣的操作無法實現快速檢測?,F下,國內也加大了對核酸法、電阻抗測量、免疫學方法、微菌落技術等各類微生物快速檢測技術展開了研究、應用。ATP生物發光法因快速、簡便且具有較高靈敏度的緣故,可用于實時監控微生物污染,與食品行業需求相符合,故而有關該技術的研究與應用十分廣泛。

            其檢測步驟通常為:
            ①首先根據ATP發光檢測試劑盒的使用說明將標準ATP按梯度稀釋,與酶、底物、緩沖液按比例混合,使用發光檢測設備(比如博鷺騰發光檢測系列)測量對應的發光值,繪制標準曲線。
            ②提取樣品細胞中的ATP,稀釋,之后按比例與酶、底物、緩沖液混合,使用發光檢測設備測定發光值,代入標準曲線,即可知道樣品中ATP濃度。(ATP濃度與細胞濃度關系的測定:取對數生長期的細胞,離心濃縮后用苔盼藍染色,計活細胞數,之后在 96孔培養板上等比稀釋,測定其發光值,發光值代入標準曲線獲得ATP濃度,經過計算即可獲得ATP濃度與細胞濃度關系。)

            應用案例:

                     

                               酒類制作過程中微生物濃度檢測                                                               食品生產線衛生學檢測

                      

                                 環境保護部門水體微生物檢測                                                衛生監管部門微生物數量檢測

            對應文獻:
            [1]吳慧清.ATP生物發光法飲用水中細菌總數快速測定方法研究[J].中國衛生檢驗雜志,2009,19(9):1975-1978.
            [2]劉陽,牟金明.ATP生物發光法快速測定物體表面的菌落總數[J].安徽農業科學,2016,44(1):125-128.
            [3]易琳.微生物檢測中 ATP 生物發光法的應用研究現狀[J].生物化工,2019,5(1):124-126.
            [4]高紅閣.ATP 生物熒光法在衛生監督工作中的應用進展[J].疾病監測與控制雜志,2013,7(9):548-550.
            [5]伍季.ATP生物發光法快速檢測啤酒中的菌落總數[J].河南科學,2006,24(1):63-65.
            [6]李春艷,霍貴成.ATP生物發光法快速測定生乳中微生物總數的研究[J].食品工業科技,2008,29(7):233-238.
            [7]魏樹源.三磷酸腺苷生物發光快速微生物檢測法在疫苗中間品無菌試驗中的應用[J].中國生物制品學雜志,2010,23(10):1120-1124.
            [8]叢苑,李平蘭.ATP 發光法快速檢測玉米中的霉菌[J].中國食品學報,2014,14(8):233-238.



            02
            藥物敏感實驗


                  化療是惡性腫瘤主要治療手段之一,其地位已越來越重要。但因為不同類型的腫瘤以及不同個體的同類腫瘤存在異質性,以致慣用的經驗式化療效果尚不理想。臨床上迫切需要有切實可靠的檢測方法,在化療實施前篩選出有效藥物,進行個體化治療,以提高療效而減少毒副作用。
            ATP生物發光法是近年來發展起來的一種高度敏感的藥物敏感試驗。文獻表明 ,將ATP生物發光法應用于臨床個體腫瘤藥物敏感性的預測,與臨床有較好的相關性。

            基本思路為:
            ①將癌細胞與藥物體外混合培養一段時間。

            ②與食品安全檢測類似:繪制發光標準曲線→測定與藥物混合培養細胞的發光值→代入標準曲線,最后計算出藥物對腫瘤的殺傷強度。


            應用案例:
                  

                                       化療藥物篩選                                                                       結核藥物篩選

                   

                                        細胞活性測定                                                                             中醫療效評價

            對應文獻:
            [1]周旻.ATP生物發光法檢測卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性[J].廣東醫學,2000,21(4):293-295.
            [2]陳歷排.用微量板 ATP生物發光法檢測腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[J].腫瘤,2000,20(2):103-105.
            [3]劉君.三磷酸腺苷發光法快速檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥的研究[J].現代預防醫學,2014,41(1):108-113.
            [4]梁鎮興.利用自主發光結核分枝桿菌快速連續檢測抗結核藥物的細胞內活性[J].實用醫學雜志,2013,29(23):3823-3826.
            [5]張志敏.ATP釋放法測定人外周血NK細胞活性及初步臨床應用[J].免疫學雜志,1992,8(4):260-261.
            [6]湛學軍.三磷酸腺苷生物發光法分析莪術油等中藥抑制肝、胃癌細胞增殖活性的研究[J].江西醫藥,2005,40(11):706-708.
            [7]朱云仙.養心2號方對慢性心力衰竭大鼠心肌組織ATP及MMP的影響[J].南京中醫藥大學學報,2016,32(3):274-278.
            [8]彭艷.艾灸對脾虛大鼠空腸組織ATP含量和ATP酶活性的影響[J].中國現代醫學雜志,2013,23(1):8-13.

            高靈敏度板式發光檢測儀Lux-P110:目前已被多家學校、醫院、企業所使用,具有極高的靈敏度(≤10amolATP或≤20zmol 螢光素酶)、超寬的線性范圍(≥6個數量級),同時配備了兩個原位進樣器,支持雙螢光素酶報告體系的檢測。

            高靈敏度管式發光檢測儀Lux-T020:管式發光檢測儀主要針對單樣品發光檢測的客戶,相比于Lux-P110,體積更加小巧,使用更加方便,靈敏度則與Lux-110相同。該系列設備支持試用,歡迎您與我們聯系。



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